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  2. 技術文章

    PCR試劑盒使用前后的注意事項

      PCR試劑盒里分好幾部分,最重要的是PCR反應體系:DNA聚合酶,鎂離子,引物(測2個基因和1個內標需要3對引物),探針(也要3對探針,發出三種波長的熒光),逆轉錄酶,dNTP(ATUCG會用部分U代替T),還有用于抗干擾的UDG酶(正常的DNA只有ATCG,PCR擴增出來的DNA會有AT(會用部分U代替T)CG,這樣擴增出來的DNA鏈中有U,UDG酶能切斷含U的DNA鏈,所以擴增DNA在空氣中形成的氣溶膠,不會影響其他樣本)、RNA酶抑制劑(空氣中液體里全都是RNA酶,會降解病毒的RNA)、Taq酶的抗體(Hotstart,常溫下能抑制Taq酶的活性,PCR擴增時高溫讓其失活,Taq酶就在高溫時恢復活性開始擴增了)。
      PCR試劑盒注意事項
      一、試劑盒使用注意事項
     ?。?)所有試劑應按照適合溫度儲存。請勿反復凍融。
     ?。?)使用后均需要對操作區進行消毒,消毒方式可以采用75%乙醇或核酸消除劑等。耗材均需使用商品化的無酶耗材。
      二、樣本注意事項
     ?。?)細胞在含/不含血清的環境中均可直接使用試劑盒。
     ?。?)擴增2kb以內片段,細胞樣品濃度不超過1000個細胞。如若擴增片段超過2kb,可適當提高細胞濃度。
     ?。?)不同組織使用不同的眼科剪和眼科鑷進行處理,防止交叉污染導致檢測結果偏差。
      三、試劑盒使用過程中注意事項
     ?。?)PCR過程中推薦使用陰性對照和陽性對照。
     ?。?)整個過程中使用的吸頭、離心管等耗材應丟棄在含有75%乙醇或核酸消除劑的容器中,防止形成環境污染。
     ?。?)PCR產物3’末端含有A,可直接進行TA克隆。
      四、試劑盒使用后注意事項
     ?。?)PCR反應完成后,嚴禁在實驗區開蓋。應在污染區進行瓊脂糖凝膠電泳,防止氣溶膠污染。
     ?。?)為防止試劑盒污染,請勿將不同批號試劑盒混用。
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